Uszkodzenie błony komórkowej hepatocyta jako istotny czynnik w alkoholowej
Uszkodzenie błony komórkowej hepatocyta jako istotny czynnik w
alkoholowej chorobie wątroby; efekty podawania fosfatydylocholiny
Hepatocyte cell membrane damage as significant factor in alcoholic liver disease;
effects of phosphatidylcholine dosage
Helmut K. Seitz
Department of Internal Medicine, Salem Medical Centre, Heidelberg, Germany
Skróty: ALD alkoholowa choroba wątroby, ADH dehydrogenaza
alkoholowa, SAM S- adenozylometionina, PC fosfatydylocholina
Patogeneza alkoholowej choroby wątroby (ALD) jest złożona. Składają się na nią
zmiany równowagi oksydoredukcyjnej w czasie przemiany etanolu z następowymi zmianami
metabolizmu pośredniego w wątrobie, produkcja aldehydu octowego (AA) przez
dehydrogenazę alkoholową (ADH) oraz aktywność cytochromu P4502E1 (CYP2E1). AA szybko
łączy się z białkami i DNA, powodując zaburzenia strukturalne i czynnościowe w
organellach i enzymach komórek wątrobowych ze zmniejszeniem ilości glutationu,
uszkodzeniem mitochondriów i mikrotubul, upośledzeniem działalności enzymów
naprawczych, jak również produkcją przeciwciał indukowanych przez działanie AA na
hepatocyty, produkcja wolnych rodników przez CYP2E1, w tym rodnika hydroksyetylowego,
który powoduje peroksydację lipidów i uszkodzenie błon komórkowych, interakcja z
przemianą wielu ksenobiotyków, w tym leków i prokarcynogenów, co powoduje zwiększenie
ich toksyczności oraz ich aktywację, niedożywienie i niedobór wielu witamin i
pierwiastków śladowych, które mają znaczenie w zachowaniu integralności komórki
wątrobowej, endotoksyny pochodzące z przewodu pokarmowego, które powodują uwalnianie
cytokin z makrofagów i komórek Browicz-Kupffera w wątrobie. Do charakterystycznych cech
ALD należą włóknienie oraz zmiany w obrębie błon komórkowych hepatocytów, które
dotyczą m.in. fosfolipidów. Metionina odgrywa zasadniczą rolę w przemianie
fosfolipidów oraz w strukturze i funkcji błony komórkowej. Aktywna metionina, czyli S-
adenozylometionina (SAM), jest ważnym prekursorem w procesie metylacji DNA oraz syntezie
błony komórkowej. Przewlekłe spożywanie alkoholu powoduje zmniejszenie syntezy SAM i
hamuje czynność metylotransferazy. Poza tym prowadzi do zmniejszenia zapasów kwasu
foliowego i witaminy B6, co dodatkowo nasila niedobór SAM. Taka sytuacja sprzyja
uszkodzeniu błony komórkowej i zwiększeniu poziomu homocysteiny (czynnika ryzyka
choroby wieńcowej). W celu ominięcia tych wywołanych alkoholem defektów enzymatycznych
przeprowadzono bezpośrednią suplementację fosfolipidami w różnych badaniach. Lieber i
wsp. prowadzili wiele badań na szczurach i pawianach, przewlekle dodając
wielonienasyconą lecytynę do diety zawierającej alkohol oraz do diety kontrolnej.
Wykazali, że podawanie fosfolipidów zawierających wielonienasycone kwasy tłuszczowe
chroni przed włóknieniem wątroby wywołanym przez etanol i jest związane ze zmiennym
spadkiem przemiany lipocytów w komórki przejściowe. Ponadto wykazano, że
fosfatydylocholina pobudzała aktywność kolagenazy w hodowli lipocytów i stwierdzono,
że jedynie dilinoleilofosfatydylocholina odpowiadała za ten efekt. Dodatkowo
podawanie fosfatydylocholiny ogranicza hamujący wpływ etanolu na aktywność
fosfatydyloetanoloamino-N-metylotransferazy i koryguje niedobory fosfolipidów i
fosfatydylocholiny. Fosfatydylocholina zmniejsza nasilenie alkoholowego stłuszczenia
wątroby i hiperlipemii u szczurów być może w mechanizmie przeciwdziałania
uszkodzeniu mitochondriów wywołanemu przez etanol. Nowe dane wykazują znamienny wpływ
fosfatydylocholiny na stres oksydacyjny spowodowany przez etanol. Podsumowując należy
stwierdzić, że istotnym czynnikiem w ALD wydaje się być ograniczona dostępność
aktywowanej metioniny, która wynika z niedoboru jej prekursorów i upośledzenia
czynności enzymów biorących udział w produkcji SAM. SAM jest ważnym prekursorem
potrzebnym w syntezie polienylofosfatydylocholiny (PPC), będącej istotnym składnikiem
prawidłowych błon komórkowych. Podawanie polienylofosfatydylocholiny szczurom i
pawianom prowadzi do poprawy czynności błon komórkowych, zmniejszenia włóknienia oraz
ograniczenia stresu oksydacyjnego.
Słowa kluczowe: alkoholowa choroba wątroby, fosfatydylocholina,
S-adenozylometionina
The pathogenesis of alcoholic liver disease (ALD) is complex. It includes changes in
hepatic redox state during ethanol metabolism with consecutive alterations of the
intermediary metabolism in the liver, production of acetaldehyde (AA) by alcohol
dehydrogenase (ADH) and cytochrome P4502E1 (CYP2E1). AA binds rapidly to protein and DNA,
resulting in structural and functional abnormalities of hepatic organelles and enzymes
including glutathion depletion, mitochondrial and microtubular injury, affection of the
repair enzymes, and the production of antibodies AA adducts, production of free radicals
through CYP2E1 including hydroxyethyl radical which leads to lipid peroxidation and
membrane destruction, interaction with the metabolism of various xenobiotics including
drugs and procarcinogens leading to their increased toxification and activation,
malnutriton and depletion of various vitamins and trace elements which are important to
guarantee the integrity of the liver cell, endotoxins from the gastrointestinal tract
which result in liberation of cytokines from macrophages and Browicz-Kupffer cells in the
liver. Characteristic features of ALD include fibrosis and membrane alteretions with
associated phospholipid changes. Methionine plays an essential role in phospholipid
metabolism and membrane structure and function. Activated methionine, S-adenosylmethionine
(SAM), is an important precursor for DNA-methylation and membrane synthesis. Chronic
alcohol consumption leads to decreased SAM synthesis and to reduction of methyltransferase
activity. Furthermore, it decreases folate and vitamin B6, which further aggravates the
reduction of SAM. As a result, membrane injury is promoted and homocystein is increased (a
factor for coronary heart disease). To bypass these enzyme defects, phospholipdids were
supplemented directly in a variety of experiments. Lieber and co-workers performed various
studies in rats and baboons with polyunsaturated lecithin administered either to
ethanol-containing or control diets for long periods of time. They found a protective
action against the fibrogenic effects of ethanol when polyunsaturated phospholipids were
administered. associated with significantly decreased activation of lipocytes to
transitional cells. More-over, phosphatidylcholine stimulated collagenase activity in
cultured lipocytes and it was found that only dilinoleoylphosphatidylcholine was
responsible for this effect. In adddition, phosphatidylcholine administration ameIiorates
the ethanol-induced decrease in phosphatidyl ethanolamine-N-methyltransferase activity and
corrects phospholipid and phosphatidylcholine depletion. Phosphatidylcholine attenuates
also alcohol-induced fatty liver and hyperlipemia in rats, possibly by an improvement of
the ethanol-induced inhibition of mitochondrial function. More recent data show an
additional significant effect of polyenylphosphatidylcholine on ethanol-induced oxidative
stress. In conclusion, it seems that one important factor in ALD is the limited
availability of activated methionine due to reduction of its precursors and a decrease of
enzyme activities involved in the production of SAM due to alcohol. SAM is an important
prerequisite for the synthesis of polyenylphosphatidylcholine, a major constituent of
intact hepatic membranes. The application of polyenylphosphatidylcholine to rats and
baboons leads to improved membrane function, to decreased fibrosis, and to a decrease in
oxidative stress.
Key words: alcoholic liver disease, phosphatidylcholine,
S-adenosylmethionine
Patogeneza alkoholowej choroby wątroby (ALD) jest złożona (1). Do jej składowych
zalicza się zaburzenia równowagi oksydoredukcyjnej w wątrobie w przebiegu przemiany
etanolu oraz następowe zmiany w produkcji metabolitów pośrednich. W czasie utleniania
etanolu przez dehydrogenazę alkoholową (ADH) dochodzi do zwiększenia stężenia NADH w
wątrobie. Taki wzrost równoważników wodorowych hamuje beta-oksydację kwasów
tłuszczowych, zwiększa syntezę kwasów tłuszczowych i triacyloglicerole oraz prowadzi
do nagromadzenia mleczanu pochodzącego z pirogronianu, czego następstwem jest
hipoglikemia, hipolaktacydemia, kwasica oraz hiperurykemia. Dochodzi ponadto do produkcji
aldehydu octowego zarówno przez ADH, jak i przez cytochrom P4502E1 (CYP2E1). Aldehyd
octowy łączy się z błonami, w tym z błonami mitochondriów, oraz z mikrotubulami, co
staje się przyczyną zmian morfologicznych i czynnościowych, dotyczących ultrastruktury
hepatocyta. Następstwem tego jest ograniczenie utleniania aldehydu octowego, gdyż
główny enzym odpowiedzialny za degradację aldehydu octowego, czyli dehydrogenaza
aldehydu octowego (ALDH2), znajduje się wewnątrz mitochondriów. W wyniku uszkodzenia
mikrotubul, nie dochodzi do wydzielania makrocząsteczek, takich jak albumina, transferyna
i lipoproteiny. Aldehyd octowy zmniejsza również zapasy glutationu głównego
czynnika odtruwającego. Aldehyd octowy ogranicza aktywność naprawczego systemu DNA
jądra komórkowego oraz wiąże się z białkami, tworząc neoantygeny, które indukują
syntezę skierowanych przeciwko nim przeciwciał. Warto zwrócić uwagę, że aldehyd
octowy jest również produkowany przez bakterie w jelicie grubym, skąd jest wchłaniany
do układu wrotnego i przenoszony do wątroby, gdzie może wywierać toksyczne działanie
w stosunku do powierzchni błon komórek wątrobowych (13). Poza przemianą z udziałem
ADH, alkohol podlega także utlenieniu przez CYP450E1, w wyniku której powstaje nie tylko
aldehyd octowy, ale również wolne rodniki, wśród nich rodnik hydroksyetylowy, który
odpowiada między innymi za peroksydację lipidów oraz niszczenie błon komórkowych.
Opisano przeciwciała skierowane przeciw tym rodnikom (1).
Interakcja, jaka zachodzi pomiędzy przemianą etanolu a przemianą rozmaitych leków,
ksenobiotyków i prokarcynogenów, może stanowić wyjaśnienie mechanizmu uszkodzenia
wątroby, do jakiego dochodzi przy współistnieniu tych substancji w ustroju (6, 14).
Wśród innych czynników, mających udział w rozwoju ALD, należy wymienić
niedożywienie, które wiąże się z niedoborem witamin i pierwiastków śladowych (m.in.
kwas foliowy, witaminy B6, B1, A oraz cynk) (15). Dodatkowo
endotoksyny, pochodzące z przewodu pokarmowego, powodują wyzwalanie cytokin z komórek
Browicz-Kupffera i makrofagów, co ma miejsce zwłaszcza w alkoholowym zapaleniu wątroby
(3). Do charakterystycznych cech ALD należą uszkodzenia błon komórkowych spowodowane
peroksydacją lipidów z towarzyszącymi zmianami w składzie fosfolipidów i pojawieniem
się cech włóknienia wątroby. Lecytyna (fosfatydylocholina PC) jest ważnym
składnikiem błon biologicznych. Składa się ona z glicerolu, długołańcuchowych
kwasów tłuszczowych (najczęściej osiemnastowęglowych) oraz choliny. Do produkcji
lecytyny konieczna jest dobra biodostępność choliny a także sprawny proces metylacji
etanoloaminy. Do wydajnej metylacji potrzebna jest natomiast obecność aktywowanej
metioniny, S-adenozylometioniny (SAM). Przewlekłe spożywanie alkoholu prowadzi do
obniżenia syntezy SAM poprzez hamowanie aktywności metylotransferazy (8). Dodatkowo u
alkoholików spożycie choliny jest obniżone, a poziom folianu, ważnego źródła C1,
obniża się w przebiegu przewlekłego spożycia alkoholu (16). Niedobór ten wynika
zarówno z przewlekłego spożywana alkoholu, jak i upośledzonego wchłaniania oraz
wzmożonej degradacji w obecności aldehydu octowego (16). Do odnowienia zapasów kwasu
foliowego potrzebna jest również witamina B6, której niedobór występuje u
alkoholików. Tak więc, niedobór witaminy B6, niski poziom folianu i choliny
oraz zmniejszona aktywność metylotransferazy w sumie wywołują niedobór SAM.
Następstwem tego ostatniego jest obniżenie metylacji zasad cytozynowych w obrębie DNA
(który może brać udział w karcynogenezie związanej z alkoholem), ograniczenie syntezy
błon biologicznych i ich uszkodzenia, a także zwiększenie poziomu homocysteiny, o
której wiadomo, że jest ważnym czynnikiem ryzyka choroby wieńcowej.
W celu wykrycia sposobów ominięcia defektu metylotransferazy spowodowanego przez etanol,
Lieber i wsp. wykonali serię prac badawczych nad wzbogaceniem diety u szczurów i
pawianów polienylofosfatydylocholiną. Autorzy ci podawali zwierzętom dietę
zawierającą alkohol w ilości pokrywającej 50% dostarczanej energii z dodatkiem
polienylofosfatydylocholiny lub bez takiego dodatku. W serii prac badawczych stwierdzili,
że polienylofosfatydylocholina otrzymana z ziaren soi, zawierająca 55-60% DLPC lub
92-96% DLPC, zapobiega włóknieniu wątroby u pawianów u których stosowano alkohol (6,
9). Poza tym PC zapobiegała przemianie lipocytów w komórki przejściowe, produkujące
kolageny i inne białka macierzy pozakomórkowej odpowiedzialne za procesy włóknienia
(6, 9). W czasie prób wyjaśnienia mechanizmu zapobiegania za pomocą PC włóknieniu
wątroby u pawianów, stwierdzono, że jedynie użycie dilinolenofosfatydylocholiny (DLPC)
odpowiada za działanie, jakie PC wywierała na kolagenazę, podczas gdy inne składniki
PC ani fosfatydyloetanoloamina nie wywierały takiego wpływu (5). Wydaje się, że PC
hamuje włóknienie poprzez pobudzanie kolagenazy do rozkładu kolagenu. Wykazano, że
polienylofosfatydylocholina selektywnie hamuje gromadzenie kolagenu powodowane przez
aldehyd octowy w hodowlach lipocytów. Było to wynikiem zwiększenia aktywności
kolagenazy, a nie modyfikacji działania aldehydu octowego, które polega na zwiększeniu
syntezy mRNA dla alfa-1- prokolagenu (5).
Jak już wspomniano, aktywność wątrobowej metylotransferazy fosfatydyloetanoloaminowej
(PEMT) ulega obniżeniu podczas przewlekłego spożywania alkoholu (8). Synteza PC może
przebiegać dwoma torami. Główną i dotyczącą większości komórek jest droga z
wykorzystaniem cytydylodwufosfocholiny (CDP-choliny). W wątrobie istnieje jednak droga
alternatywna, N- metylacji fosfatydyloetanoloaminy. Odpowiada ona za produkcję ok. 30% PC
i wymaga obecności aktywnej metioniny (17). W szlaku tym PEMT odgrywa kluczową rolę
przy produkcji błonowej PC. Wykazano, że spożycie alkoholu obniża aktywność tego
enzymu jeszcze zanim dojdzie do marskości wątroby, powodując zmniejszenie zapasów PC w
wątrobie, co może sprzyjać uszkodzeniu wątroby i wywoływać proces włóknienia. Z
drugiej strony podawanie PC przeciwdziała obniżeniu aktywności PEMT, jakie powoduje
etanol, jak również koryguje niedobór fosfolipidów i PC, chroniąc w ten sposób,
przed alkoholowym uszkodzeniem wątroby (6, 9).
W tym kontekście interesująco brzmią dane wstępne, które sugerują, że PC zapobiega
peroksydacji lipidów w wątrobie i zmniejsza uszkodzenie powodowane u szczurów przez
czterochlorek węgla (2). Badania te przeprowadzono również na pawianach, wykonując
biopsje wątroby u tych zwierząt poddanych działaniu etanolu z dodatkiem, i bez,
polienylofosfatydylocho-liny (PPC). Wykazano, że stężenia zarówno 4-hydroksynonenalu,
jak i F2-izoprostanu były istotnie niższe w grupie otrzymującej PPC w porównaniu z
grupą otrzymującą wyłącznie etanol (7). Dodatkowo stwierdzono zmniejszenie
poalkoholowego niedoboru glutationu (7). Produkty peroksydacji lipidów pobudzają
włóknienie, dlatego obniżenie ich stężenia przy podawaniu PPC może mieć znaczenie
dla stwierdzonego u pawianów i w warunkach in vitro hamowania włóknienia.
Stosowanie PPC stwarza możliwość zapobiegania wczesnym zmianom obserwowanym w przebiegu
ALD, jak na przykład stłuszczenie wątroby. Doniesiono o korzystnym wpływie PPC u
alkoholików ze stłuszczeniem wątroby (4). W opublikowanej niedawno pracy prowadzonej na
szczurach, stwierdzono, że poalkoholowe spichrzanie lipidów i białek zostało znacznie
obniżone przez zastosowanie PPC (11). Wywołana przez etanol hiperlipemia była niższa
przy zastosowaniu PPC, niż bez niej (12). Nie wystąpiło jednak zwiększenie
wchłaniania tłuszczu i nie zaszły zmiany w poziomie wolnych kwasów tłuszczowych w
osoczu. Redukcji kwasów tłuszczowych i hiperlipemii przy stosowaniu PPC towarzyszyła
poprawa w zakresie mitochondrialnej oksydacji palmitylo-1- karnityny i aktywności
oksydazy cytochromowej hamowanych przez etanol (12). Tak więc, PPC wpływa na wczesne
objawy alkoholowej choroby wątroby, najprawdopodobniej przez wspomaganie naprawy
uszkodzeń mitochondriów.
W podsumowaniu należy stwierdzić, że chociaż patogeneza ALD jest złożona, to
powstający z alkoholu aldehyd octowy może spowodować powstawanie uszkodzeń błon
komórkowych, obniżenie zapasów glutationu, włóknienie oraz produkcję neoantygenów.
Poza tym wytwarzanie wolnych rodników przez CYP2E1 i spowodowana ich działaniem
peroksydacja lipidów mogą prowadzić do poważnego uszkodzenia komórki wątrobowej.
Dodatkowo zmiany metaboliczne związane z zaburzeniem równowagi oksydoredukcyjnej
hepatocytów prowadzą do rozwoju stłuszczenia wątroby, poprzedzającego bardziej
zaawansowane zmiany w tym narządzie.
Ważnymi cechami ALD są morfologiczne i czynnościowe zmiany w błonach komórkowych
hepatocytów, uszkodzenia mitochondriów, oraz włóknienie wątroby. To ostatnie zjawisko
może być spowodowane indukowaną przez aldehyd octowy przemianą lipocytów w
miofibroblasty, zdolne do produkcji kolagenów, a także zaburzeniami aktywności cytokin,
podobnie jak w ostrym alkoholowym zapaleniu wątroby.
Głównym warunkiem syntezy prawidłowych błon hepatocytów jest aktywność SAM
ważnego czynnika w procesach transmetylacji. Do innych należą: folian i witamina B6.
Przewlekłe spożywanie alkoholu prowadzi do niedoboru SAM. Efektem tego jest
niedostateczna metylacja DNA oraz zmniejszona synteza PC, będącej ważnym składnikiem
prawidłowych błon.
Pokarmowa suplementacja PPC u gryzoni i pawianów powoduje zwiększenie dostępności PPC
i ograniczenie alkoholowego stłuszczenia wątroby i hiperlipemii, co może wynikać z
poprawy morfologii i czynności mitochondriów. PPC zmniejsza również niedobór
glutationu spowodowany spożywaniem alkoholu oraz ogranicza ilość produktów rozpadu
peroksydowanych lipidów. Produkty te wywołują włóknienie, dlatego ograniczenie ich
ilości przez PPC może stanowić podstawę zapobiegawczego działania fosfolipidów.
Dodatkowo PPC zwiększa aktywność kolagenazy, co może nasilać degradację kolagenu i
ograniczać przemianę lipocytów w miofibroblasty, stanowiące istotny element w procesie
włóknienia.
Piśmiennictwo:
lAlbano E., Clot P., Morimoto M., Tomasi A., Ingelman-Sundberg M., French S.W.: Role of
cytochrome P4502E1-dependent formation of hydroxyethyl free radical in the development of
liver damage in rats intragastrically fed with ethanol. Hepatology, 1996, 23, 155.l
lAleynik S.I., Leo M.A., Ma X., Aleynik M.K., Lieber C.S.: Polyenylphosphatidylcholine
(PPC) prevents hepatic lipid peroxidation and attenuates associated injury induced by CCl4
in rats and by alcohol in baboons. Gastroenterology, 1995, 108, A1025.l
lBode J.C., Bode C.: Alcohol, malnutrition and the gastrointestinal tract. [w:] Watson
R.R., Watzl B. (red.): Nutrition and Alcohol. CRC Press, Boca Raton, Ann Arbor, London,
Tokyo, 1992, 403. l
lKnüchel F.: Doppelblindstudie bei Patienten mit alkoholtoxischer Fettleber. Med. Welt.,
1979, 30, 411. l
lLi J., Kim C.-I., Leo M.A., Mak K.M., Rojkind M., Lieber C.S.: Polyunsaturated lecithin
prevents acetaldehydemediated hepatic collagen accumulation by stimulating collagenase
activity in cultured lipocytes. Hepatology, 1992, 15, 373.l
lLieber C.S., DeCarli L.M., Mak K.M., Kim C.-I., Leo M.A.: Attenuation of alcohol-induced
hepatic fibrosis by polyunsaturated lecithin. Hepatology, 1990, 12, 1390. l
lLieber C.S., Leo M.A., Aleynik S.I., Aleynik M.K., DeCarli L.M.:
Polyenylphosphatidylcholine decreaes alcohol-induced oxidative stress in the baboon.
Alcoholism. Clin. Exp. Res., 1997, 21, 375. l
lLieber C.S., Robins S.J., Leo M.A.: Hepatic phosphatidylethanolamine methyltransferase
activity is decreased by ethanol and increased by phospatidylcholine. Alcoholism. Clin.
Exp. Res., 1994, 18, 592. l
lLieber C.S., Robins S.J., Li J., DeCarli L.M., Mak K.M., Fasulo J.M., Leo M.A.:
Phosphatidylcholine protects against fibrosis and cirrhosis in the baboon.
Gastroenterology, 1994, 106, 152. l
lLieber C.S.: Alcohol and the liver: 1994 update. Gastroenterology, 1994, 106, 1085. l
lNavder K.P., Baraona E., Lieber C.S.: Polyenylphosphatidylcholine attenuates
alcohol-induced fatty liver and hyperlipemia in rats. J. Nutr., 1997, 127, 1800. l
lNavder K.P., Baraona E., Lieber C.S.: Polyenylphosphatidylcholine decreases alcoholic
hyperlipemia without affecting the alcohol-induced rise of HDL-cholesterol. Life Sci.,
1997, 61, 1907. l
lSalaspuro M.: Microbial metabolism of ethanol and acetaldehyde and clinical
consequences. Add. Biol., 1997, 2, 35. l
lSeitz H.K., Osswald B.: Effect of ethanol on procarcinogen metabolism. [w:] Watson R.R.
(red): Alcohol and Cancer. CRC Press, Boca Raton, Ann Arbor, London, Tokyo, 1992, 55. l
lSeitz H.K., Suter P.M.: Ethanol toxicity and nutritional status. [w:] Kotsonis F.N.,
Mackey M., Hjelle J. (red.): Nutritional Toxicology. Raven Press, New York, 1994, 95. l
lShaw S., Jayatilleke E., Herbert V., Colman N.: Cleavage of folates during ethanol
metabolism: role of acetaldehyde/xanthine oxidase generated superoxide. Biochem. J., 1989,
257, 277.l
lSundler R., Akesson B.: Regulation of phospholipid biosynthesis in isolated rat
hepatocyte. J. Biol. Chem., 1975, 250, 3359. l
Adres do korespondencji:
Prof. Dr med. Helmut Seitz
Krankenhaus Salem Zeppelinstrasse 11-33
69121 Heildelberg
Germany
Hepatologia Polska 1998, 5(supl. 2), 13-16
Wydawnictwo "VOLUMED"
Ul. Olsztyńska 3
51-423 Wrocław
zanotowane.pldoc.pisz.plpdf.pisz.plteen-mushing.xlx.pl